樹突狀細胞原代培養(yǎng)實驗

一、實驗前準備

材料與試劑

• ?實驗動物?：6-12周齡C57BL/6小鼠(推薦雌性)68

• ?基礎培養(yǎng)基?：RPMI-1640(含10%FBS、2mM L-谷氨酰an、1%雙抗)38

• ?關鍵細胞因子?：

• GM-CSF(20ng/ml)68

• IL-4(10ng/ml，用于外周血DC培養(yǎng))5

• ?其他試劑?：

• 紅細胞裂解液(Tris-NH4Cl)3

• 0.125%蛋白酶(用于組織消化)4

• Percoll分離液(用于外周血DC分離)5

二、骨髓來源DC(BMDC)培養(yǎng)流程36

1. 骨髓細胞獲取

• 頸椎脫臼法處死小鼠，75%酒精浸泡消毒5分鐘38

• 無菌條件下取出股骨和脛骨3

• 用1ml注射器沖洗骨髓腔至培養(yǎng)基變渾濁3

• 1000rpm離心5分鐘收集細胞3

2. 紅細胞裂解

• 加入2ml Tris-NH4Cl裂解液，靜置1分鐘

• 加入15ml培養(yǎng)基終止反應，離心棄上清

3. 細胞培養(yǎng)

• 按5×10?/ml密度接種于未TC處理的培養(yǎng)瓶

• 添加GM-CSF(20ng/ml)和β-巰基乙醇(50μM)

• 37℃、5%CO?培養(yǎng)，每2-3天半量換液

三、外周血DC培養(yǎng)流程

1. 單個核細胞分離

• 肝素抗凝血經(jīng)Ficoll密度梯度離心

• 收集單個核細胞層，PBS洗滌2-3次

2. 貼壁篩選

• 37℃貼壁3小時，去除懸浮細胞

• 繼續(xù)培養(yǎng)過夜(12-18小時)

3. DC富集

• E花環(huán)形成法結(jié)合Percoll離心

• 抗人IgG親和吸附(Panning)進一步純化

四、培養(yǎng)觀察與鑒定

形態(tài)特征

• 初期：圓形或橢圓形

• 成熟期：典型樹突狀突起

表型鑒定(流式檢測)8

• 標志物：CD11c、MHC-II、CD80、CD86、CD40

• 純度要求：CD11c陽性率>90%

五、注意事項

1. ?無菌操作?：全程超凈臺內(nèi)完成

2. ?細胞因子濃度?：GM-CSF濃度影響DC產(chǎn)量

3. ?成熟誘導?：可添加LPS或TNF-α促進成熟

4. ?功能檢測?：混合淋巴細胞反應(MLR)驗證抗原提呈能力

5. ?應用時機?：培養(yǎng)7-10天為最佳使用期